醫(yī)療化學(xué)檢驗(yàn)：代謝組樣品收集方案
代謝組學(xué)研究的樣本主要是尿液、血漿或血清、唾液，以及細(xì)胞和組織的提取液等。由于代謝譜容易受到眾多因素的影響，收集代謝組學(xué)研究的樣本需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，樣本特征進(jìn)行嚴(yán)格的控制，考慮收集的時(shí)間、樣本的保存條件和保存時(shí)間等的平行性。特別是臨床生物樣本不易控制，要考慮受試患者和健康對(duì)照人群之間的年齡、性別、飲食狀況、作息習(xí)慣、體重、用藥情況等因素的匹配。這些因素的改變均可導(dǎo)致代謝譜的變化，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
特別注意，樣本采集時(shí)需要第一時(shí)間使用萃滅：快速使組織或細(xì)胞內(nèi)的酶失活，防止代謝物的變化。液氮速凍是常用的萃滅方式。下面給大家詳細(xì)介紹一下各類型樣品的收集方法：
一、血清、血漿樣本收集
1.血清與血漿相比，血清不含纖維蛋白原。
2.血清中代謝物的含量略高于血漿，血清和血漿均可用于代謝組學(xué)研究，但是取樣盡量一致，要么都用血清，要么都用血漿。
1. 血清
1.1 樣品量要求
NMR實(shí)驗(yàn)500μL/樣本；GC-MS，LC-MS實(shí)驗(yàn)200μL/樣本，避免反復(fù)凍融。
1.2 樣本收集步驟
1）血液收集在離心管中37°C(或室溫)靜置30min或1h進(jìn)行凝固分層；
2）3000rpm室溫離心10min，待血細(xì)胞完全沉降到管底后，取上清轉(zhuǎn)至干凈的離心管中；
3）再12000rpm4°C離心10min，取上清分裝到1.5mL離心管中，每管 0.2mL，-80°C凍存，干冰寄送。
1.3 注意事項(xiàng)
1）取血時(shí)如用酒精消毒，請(qǐng)擦干擦拭部位，待酒精完全揮發(fā)后再取樣；
2）取血時(shí)如用麻醉劑，建議用異氟醚，防止在NMR血清譜圖中出現(xiàn)干擾峰；
3）血清參考產(chǎn)率≈30%-50%，例如1mL全血大約能得 0.3-0.5mL血清；
4）采全血時(shí)如使用真空采血管，請(qǐng)務(wù)必使用無(wú)預(yù)加抗凝劑的凝血管；
5）建議盡量多的收集樣本并分裝凍存，且避免反復(fù)凍融。
2. 血漿
2.1 樣品量要求
NMR 實(shí)驗(yàn)500μL/樣本；GC-MS，LC-MS 實(shí)驗(yàn)200μL/樣本，避免反復(fù)凍融。
2.2 樣本收集步驟
應(yīng)使用肝素鈉抗凝管采集全血，并盡快進(jìn)行血漿分離：3000rpm室溫離心10min，待血細(xì)胞完全沉降到管底后，取上層，0.2mL/管分裝至1.5mL離心管中。-80°C凍存，干冰寄送。
2.3 注意事項(xiàng)
1）取血時(shí)如用酒精消毒，請(qǐng)擦干擦拭部位，待酒精完全揮發(fā)后再取樣。
2）對(duì)于抗凝管的選擇：代謝組學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)推薦使用肝素鈉抗凝管（因?yàn)闄幟仕崾荰CA循環(huán)中的重要物質(zhì)，使用檸檬酸鈉抗凝劑會(huì)引入外源污染；EDTA 會(huì)影響NMR采譜）。但肝素鈉會(huì)對(duì)RNA相關(guān)實(shí)驗(yàn)有負(fù)面作用。
3）最后分裝保存推薦使用1.5mL凍存管，因?yàn)槁菘趦龃婀芄苊眱?nèi)有一個(gè)橡膠墊圈，目的是為了密封。
4）血漿參考產(chǎn)率≈50%，例如1mL全血大約能得0.5mL血漿。
二、尿液、唾液、瘤胃液、腦脊液樣本收集
1. 尿液
1.樣品量要求
1mL/例。
2.樣本收集步驟
收集尿液的前一天飲食要清淡。晨起中段尿（臨床）或晨間1h 尿（動(dòng)物），4℃10000rpm 離心10min，取上清，用1.5mL 離心管分裝保存，每管1mL，-80℃冰箱凍存。最好保存兩管，以保證兩次實(shí)驗(yàn)的量，足量干冰寄送。
3. 注意事項(xiàng)
動(dòng)物1h尿量不夠，可分多次收集，若要收取24h尿液，請(qǐng)使用帶有低溫裝置的代謝籠收取，及時(shí)凍存。
2. 唾液
1. 樣品量要求
0.5mL/例。
2. 樣本收集步驟
禁食禁煙禁酒2h以上，上午9:30-11:30 取樣，蒸餾水漱口，將唾液外吐于無(wú)菌痰杯內(nèi)（保持冰?。灰忍担占?-10min，4℃10000rpm，離心10min，取上清，再經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾除菌，500μL分裝，保存于-80℃。
3. 瘤胃液
1.樣品量要求
1mL/例，建議多取一些。
2.收集步驟
瘤胃液經(jīng)6000g離心15min，取上清，1mL分裝，-80℃凍存，干冰寄送。
4. 腦脊液
1. 樣品量要求
200μL/例。
2. 收集步驟
取樣后，4℃10000rpm離心10min，取上清，200μL分裝保存。保存于-80℃，干冰寄送。
三、細(xì)胞樣本收集
適用細(xì)胞類型：哺乳動(dòng)物細(xì)胞系
1. 樣品量要求
1×10*7 cell/樣本，提供2份樣本。
2. 樣本收集步驟
懸浮細(xì)胞：
1） 連同培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到15mL的離心管（進(jìn)口）中。
2） 1000g離心10min收集細(xì)胞（1×10*7 個(gè)細(xì)胞為宜），棄上清。
3） 用預(yù)冷的 PBS 小心重新清洗沉淀一次，1000g離心10min收集細(xì)胞，棄上清。
4） 再用PBS重懸并離心一次，倒掉PBS （盡量倒干凈），將離心管的尖端插入液氮中，萃滅細(xì)胞沉淀1min。-80°C凍存，干冰寄送。
注意事項(xiàng)：
1) 請(qǐng)先拿空離心管的尖端插入液氮中試試離心管的質(zhì)量，如果不破則沒(méi)問(wèn)題，如果插入液氮中就破了，那么就省掉萃滅這一步。
2) 操作盡量迅速，培養(yǎng)基盡量倒干凈，如有濾紙，可以用濾紙條將底部殘留的培養(yǎng)基吸盡。
貼壁細(xì)胞：
1） 棄培養(yǎng)液，并將培養(yǎng)皿倒置于吸水紙上吸干培養(yǎng)液。
2） 加入4℃預(yù)冷的PBS（若用移液槍加，則靠著培養(yǎng)皿壁加入，以免將細(xì)胞沖起），平放輕輕搖動(dòng)1分鐘洗滌細(xì)胞，然后棄PBS，重復(fù)以上操作兩次以洗去培養(yǎng)液。
3） 將培養(yǎng)皿置于冰上，向培養(yǎng)皿內(nèi)加入4℃預(yù)冷的500μL預(yù)冷的甲醇-水（4：1，V/V），用干凈的細(xì)胞刮棒將細(xì)胞刮于培養(yǎng)皿的一側(cè)（動(dòng)作要快），冰上斜置培養(yǎng)皿，使得緩沖液流向一側(cè)，用移液槍吸取細(xì)胞溶液至預(yù)冷的離心管內(nèi)。
4） 再向培養(yǎng)皿中加入500μL甲醇-水（4：1，V/V），將剩余的細(xì)胞盡量全部轉(zhuǎn)移至離心管中，1000g離心10min 收集細(xì)胞，棄上清；液氮速凍萃滅，保存于-80 ℃，干冰寄送。
注意事項(xiàng)：需使用色譜純的甲醇以及雙蒸餾水。
四 、動(dòng)物組織類樣本收集
適用于心、肝、脾、肺、腎、腸、腦、肌肉等。
1. 樣品量要求
GC-MS，LC-MS實(shí)驗(yàn)200mg/樣本。
2. 樣本收集步驟
1）如果組織上有血，用生理鹽水漂洗掉。
2）根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)取特定的部位，200mg/樣本裝入離心管中。
3）標(biāo)號(hào)后迅速放入液氮中冷凍處理至少15min，-80°C凍存；干冰寄送。
五、糞便、腸道內(nèi)容物樣本收集
1. 樣品量要求
200mg/樣本，避免反復(fù)凍融。
2. 樣本收集步驟
收集到新鮮糞便或腸道內(nèi)容物樣本后，分裝樣本200mg/管，建議分裝 15~20 管備用，立即用液氮速凍處理15min，-80°C 凍存，干冰寄送。
3. 注意事項(xiàng)
由于糞便/腸道內(nèi)容物中有非常多微生物，其代謝速度很快，反復(fù)凍融會(huì)對(duì)代謝水平有很大影響。建議樣本收集后，按照200mg/樣本進(jìn)行分裝凍存。
六、植物類樣本收集
1. 葉 片、莖、花
1.1 樣品量要求
GC-MS，LC-MS 實(shí)驗(yàn)200mg/樣本。
1.2 樣本收集步驟
取整片葉片/一段莖/一朵花，用錫箔紙包裹并標(biāo)記后，迅速放入液氮中冷凍處理至少15min。取出后迅速放入自封袋中(每組一袋)，在自封袋中放入標(biāo)簽紙注明樣本信息。迅速放入-80°C凍存，干冰寄送。
1.3 注意事項(xiàng)
1）采集葉片樣本時(shí)，最好在中午光照好的時(shí)間收集。
2）要根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，采集樣本時(shí)保持樣本一致性，尤其是同一組樣本（如顏色、衰老程度、葉脈占比、光照、位置等）。
2. 根
2.1樣品量要求
GC-MS，LC-MS 實(shí)驗(yàn)500mg/樣本。
2.2樣本收集步驟
1）取整株植物的根部，迅速用1*PBS漂洗掉根上的泥土。
2）根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)取植株根特定的部位，500mg/樣本裝入離心管中。
3）標(biāo)號(hào)后迅速放入液氮中冷凍處理至少15min。-80°C凍存，干冰寄送。
2.3注意事項(xiàng)
1）PBS漂洗要快。
2）由于根部組織特別脆弱，被擠壓后會(huì)變成漿糊狀，所以推薦保存至離心管中，而不是錫箔紙包裹。
3. 果實(shí)、種子
3.1樣品量要求
GC-MS，LC-MS 實(shí)驗(yàn)200~500mg/樣本。
3.2樣本收集步驟
1）對(duì)于含多汁、塊頭較大的果實(shí)（番茄、西瓜、蘋果等）需要先用鋒利的刀分割成“均勻”合適的小塊(≈200mg/樣本)分裝至2mL離心管中，標(biāo)號(hào)后迅速放入液氮中冷凍處理。
2）對(duì)于細(xì)小的顆粒種子(擬南芥種子、谷物種子等)，可以先將同一組的植株種子混勻后再分裝(≈200mg/樣本)至離心管中，標(biāo)號(hào)后迅速放入液氮中冷凍處理。
3）對(duì)于要求對(duì)整個(gè)果實(shí)進(jìn)行提取的（整粒葡萄等），需要把果實(shí)裝在50mL 離心管中/自封袋中，標(biāo)號(hào)后迅速放入液氮中冷凍處理。
3.3注意事項(xiàng)
1）對(duì)多汁的果實(shí)進(jìn)行取樣很難保持均一性(如番茄、皮、果肉、果瓤、籽的占比)，建議將整個(gè)果實(shí)進(jìn)行研磨、凍干，對(duì)粉末進(jìn)行稱重分裝。
2）不推薦用錫箔紙包裹。
七、微生物樣本收集
適用樣本：大腸桿菌、枯草桿菌、釀酒酵母菌、惡臭假單胞菌、酵母、棒桿菌屬、單胞藻、運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌、氧化葡萄糖酸桿菌等。
1. 菌體數(shù)量
需要菌體的數(shù)量為：1×10*8（一次實(shí)驗(yàn)的用量）。一般OD600≈0.6 時(shí)，細(xì)菌處于生長(zhǎng)指數(shù)，其濃度為10*8cell/mL。此標(biāo)準(zhǔn)為經(jīng)驗(yàn)值，需根據(jù)自己實(shí)驗(yàn)室具體情況進(jìn)行調(diào)整。
2. 取樣步驟
1） 將 1~2 mL菌液轉(zhuǎn)移到離心管（進(jìn)口）中。
2） 1000g離心10min收集菌體（1×10*8 個(gè)細(xì)胞為宜），棄上清。
3） 用預(yù)冷的PBS小心重新清洗沉淀一次，4°C1000g離心10min收集菌體，棄上清。
4） 再用PBS重懸并離心一次，倒掉PBS（盡量倒干凈），將離心管的尖端插入液氮中，萃滅細(xì)胞沉淀1min。-80°C 凍存，干冰寄送。
3. 注意事項(xiàng)
1）請(qǐng)先拿空離心管的尖端插入液氮中試試離心管的質(zhì)量，如果不破則沒(méi)問(wèn)題。
2）微生物代謝速度非常快，所有的步驟需盡快完成。
3）菌體數(shù)量不同樣本間需要保持一致；
4）OD值供參考，需要根據(jù)具體情況確認(rèn)。
4. 微生物培養(yǎng)液（研究胞外代謝）取樣步驟
方法一：培養(yǎng)好的菌液混勻后，取10mL菌液，用0.2μm 孔徑的過(guò)濾膜進(jìn)行快速抽濾，去除菌體。將濾液按1mL/well 進(jìn)行分裝，‐80°C 凍存，干冰寄送。
方法二：培養(yǎng)好的菌液混勻后，取1mL 菌液，3000rpm，4°C 離心10min，取上清800μL，‐80°C 凍存，干冰寄送。
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